2022年1月7日，中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室余佳教授团队在Science Advances发表了“Single-cell architecture and functional requirement of alternative splicing during hematopoietic stem cell formation”的论文。该研究首次在单细胞水平系统性描绘了小鼠HSC发育全程的RNA剪接图谱，并对EHT过程的关键可变剪接（alternative splicing, AS）事件及其上游调控因素进行探究，鉴定出Srsf2通过调控造血细胞特异性AS事件促进HSC发生的新机制。
        精确解析不同类型组织干细胞的发育过程将为再生医学带来新的曙光。近年来，迫切的临床需求加之体外再生效率低下，使得造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）的高效获取成为最受关注的研究领域之一。HSC发育是一个错综复杂的动态调控网络，关于其胚胎起源的时序特征、发生机制等仍存在诸多未知。精确解析HSC发生的调控规律，是指导体外功能性HSC再生的先决条件。基于单细胞全长转录组的技术，该研究构建了基于转录本层面的基因表达图谱，鉴定出一系列HEC、T1 pre-HSC阶段特异性表达的转录本。值得注意的是，某些基因仅仅呈现某个特殊转录本的造血阶段特异性表达，而这种表达差异在基因层面由于其他转录本干扰被掩盖（图1）。提示目前转录组研究以“基因”为中心的分析模式存在不足，而将同一基因的不同转录本纳入分析范畴，将为深入理解和剖析基因功能提供更多参考和依据。

图1. HSC发育全程的单细胞转录本图谱

        在上述发现基础上，作者进一步从AS角度解析T1 pre-HSC所呈现的最为显著的转录本多样性。在整个EHT过程中，共鉴定出超过一万多个AS事件，并且AS事件的发生频率在T1 pre-HSC阶段达到峰值，与其显著的转录本多样性吻合。借助单细胞测序的优势，作者在随后分析中引入“modality”的概念，即：根据AS事件在同一细胞群体内的分布情况将其分为5种模式。作者有趣地发现，伴随细胞命运从内皮向造血的逐步转换，“included”类型的AS事件也呈现分阶段产生的特征，包括分别鉴定出的979个HEC阶段开始出现的“included”AS事件，以及822个T1 pre-HSC阶段开始出现“included”AS事件。由于上述AS事件均特异性发生在具备造血潜能的细胞群体中，我们将其统称为造血细胞特异性“included”AS事件，而这些事件很可能为HSC产生所必需（图2）。

图2. EHT过程中造血细胞特异性“included”AS事件的鉴定

 为了探究调控这些AS事件的上游因素，作者通过对其旁侧序列的RNA motif分析，预测出若干剪接因子结合位点，并结合候选剪接因子在EHT过程的表达变化，选定Srsf2为后续研究对象。作者随后构建了条敲小鼠模型，发现内皮细胞Srsf2缺失导致主动脉内造血簇数量的显著减少，HEC比例也显著降低。继而，作者通过AGM区的组织块培养及后续移植发现，Srsf2突变胚胎的嵌合率显著降低，同时伴随髓系、B细胞和T细胞的重建缺陷。最后，作者对Srsf2缺失的HEC群体进行少量细胞RNA-seq分析，结果显示，Srsf2缺失造成HEC细胞AS谱的整体改变，其中不乏调控HSC发生的关键转录因子，如：Runx1和Myb等。因此，Srsf2可以通过改变EHT过程中关键基因的剪接模式，在HSC发生中发挥不可或缺的作用。

该研究拓展了我们对于HSC发育过程转录组认识的深度和广度，使我们从RNA可变剪接角度重新审视EHT过程，并证明可变剪接可通过改变基因特定转录本的表达发挥调控细胞命运的重要作用。

本研究工作得到中国医学科学院医学科学创新基金（Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences）（项目编号：2021-I2M-1-019和2021-I2M-1-040）、国家重点研发计划项目（项目编号：2019YFA0801800,2019YFA0111700,2017YFA0103401,2016YFA0100601, 2020YFA0112402）等项目的资助。中国医学科学院基础医学研究所余佳教授、暨南大学兰雨研究员、解放军总医院第五医学中心刘兵研究员、南方医科大学王栋教授为本文的共同通讯作者。中国医学科学院基础医学研究所王芳教授、任悦博士，南方医科大学谭普文博士，军事医学研究院张鹏程博士为本文的共同第一作者。

论文链接:

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abg5369